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技術(shù)文章

PCR實驗常見失敗原因、及對策分析及體系優(yōu)化

技術(shù)文章

PCR雖然為一個簡單的實驗,但在實際過程中可能會出現(xiàn)各種問題。產(chǎn)生問題的原因可能來源于以下幾個方面:實驗操作,試劑質(zhì)量,PCR反應(yīng)過程中各種試劑的含量,以及反應(yīng)條件,溫度設(shè)置等,本文對各個方面進(jìn)行了討論,大家遇到問題后可以對號入座的查一下。當(dāng)然,具體問題的解決還依靠實驗者就可能的原因逐項排除,并不斷的摸索才能*解決。

假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶?

      PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及,④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。?

??    模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消?化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。⑤模?板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時,不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處?理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)?固定不宜隨意更改。?

??   酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而?導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。?

??   引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不?理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度?高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴(kuò)增,對策為:①選定一個好的引物合成單?位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。?

??   Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特?異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。?

??   反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul,應(yīng)用多?大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul?后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。?

??   物理原因:變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計,檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。?

??   靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某?段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會成功的。??

假陽性?

??   出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。???引物設(shè)計不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

      靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時,在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。??

出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶?

      PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶?與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不*互補(bǔ)、?或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)?過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶?則不出現(xiàn),酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有:必要時重新設(shè)計引?物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次?數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。?

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶?

??   PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量?差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有:減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃?度。增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。?

?

克隆PCR產(chǎn)物?

1)克隆PCR產(chǎn)物的理想條件是什么??

插入片段:載體比需實驗確定。1:1(插入片段:載體)常為理想比,摩爾數(shù)比1:8或8:1也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul?2X連接液,?50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,插入片段共10ul。室溫保溫1小時,或4℃過夜。在這2種溫度下,缺T-凸出端的載體會自連,產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時能滿足大多數(shù)克隆要求,為提高連接效率,需4℃過夜。?

2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化??

如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶,不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶,可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高,這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆,而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。??

3)如果沒有回收到目的片段,還需要作什么對照實驗??

A)涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。?

如有菌落,表明氨芐失效,或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒,或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。?

B)轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒,計算菌落生長數(shù),測定轉(zhuǎn)化效率。?

例如,將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后,用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜,產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為:?產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。?

鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng?DNA,用SOC

稀釋到1000u后含10ng?DNA,用1/10鋪板,共用1ng?DNA。轉(zhuǎn)化率為:?

1000克隆X10(3次方)ng?/鋪板1ng?DNA?ug=10(6次方)cfu/?ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10(8次方)cfu/ug感受態(tài)細(xì)胞?如沒有菌落或少有菌落,感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。?

C)如用pGEM-T正對照,或PCR產(chǎn)物,產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑(用步驟10(8次方)cfu/?ug感受態(tài)細(xì)胞),表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4?DNA連接酶(M1801,M1804,M1794)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染,不應(yīng)用其它來源的T4?DNA連接酶替換。

D)用pGEM-T或pGEM-T?Easy載體,連接pGEM-T正對照,轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞(10(8次方)cfu/ug),按照的實驗步驟,可得100個菌落,其中60%應(yīng)為白斑,如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑,?沒有菌落或少有菌落,連接有問題。?

4)對照實驗結(jié)果好,卻沒有回收到目的片段,實驗出了什么問題??

A)連接用室溫保溫1小時,能滿足大多數(shù)克隆,為提率,需4℃過夜。

B)插入片段帶有污染,使3`-T缺失,或抑制連接,抑制轉(zhuǎn)化。為此,將插入片段和pGEM-T正對照混合,再連接。如降低了對照的菌落數(shù),插入片段需純化,或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T?Easy載體3`-T缺失。?

C)插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段,因受UV過度照射,時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體,不利于連接,DNA必需重新純化。?

D)帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM-T?Easy載體克隆所需。加Taq?DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T?pGEM-T?Easy載體技術(shù)資料(TM042)。?

E)高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定,在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排,如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排,需用重組缺陷大腸桿菌菌株,如SURE細(xì)胞???

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系:?

10×擴(kuò)增緩沖液?????????10ul?

4種dNTP混合物???????各200umol/L?

引物???????????????各10~100pmol/L?????????

模板DNA???????????0.1~2ug?????????

Taq?DNA聚合酶???????2.5u?????????

Mg2+????????????1.5mmol/L????????

加雙或三蒸水至????????100ul?

PCR反應(yīng)五要素:參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+??

?     引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則:?

①引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。?

②引物擴(kuò)增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。?

③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC隨機(jī)分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。?

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會形成引物

二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。?

⑤引物3'端的堿基,特別是末及倒數(shù)第二個堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。?

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,?被擴(kuò)增的靶序列應(yīng)該有適宜的酶切位點,?這對酶切分析或分子克隆很有好處。?

⑦引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量:?每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。酶及其濃度?目前有兩種Taq?DNA聚合酶供應(yīng),一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。?

??   dNTP的質(zhì)量與濃度?dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應(yīng)配成高濃度后,以1M?NaOH或1M?Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0~7.5,小量分裝,-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(?等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。?

??   模板(靶基因)核酸?模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是:溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與甲烷抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本,可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。?

????Mg2+濃度?Mg2+對PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過低會降低Taq?DNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。??

??   PCR反應(yīng)條件的選擇?

?  ? PCR反應(yīng)條件為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。?

??   溫度與時間的設(shè)置:基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40?~60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在Taq?DNA?聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq?DNA酶仍有較高的催化活性)。?

①變性溫度與時間:變性溫度低,解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的主要原因。一般情況下,93℃~94℃min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性,就會導(dǎo)致PCR失敗。

②退火(復(fù)性)溫度與時間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA?比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:?

????Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)?

????復(fù)性溫度=Tm值-(5~10℃)?在Tm值允許范圍內(nèi),選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30~60sec,足以使引物與模板之間*結(jié)合。

③延伸溫度與時間:Taq?DNA聚合酶的生物學(xué)活性:??????????

70~80℃?150核苷酸/S/酶分子??????????

70℃?60核苷酸/S/酶分子??????????

55℃?24核苷酸/S/酶分子?

高于90℃時,DNA合成幾乎不能進(jìn)行。?

??   PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時間1min是足夠的。3~4kb的靶序列需3~4min;擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增,延伸時間要稍長些。



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