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牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)中的作用與質(zhì)量要求

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生物技術(shù)已經(jīng)被世界各國(guó)視為一種高技術(shù),在整個(gè)科學(xué)技術(shù)中占據(jù)了特殊的顯著地位,特別是生命科學(xué)的發(fā)展更 離不生物技術(shù),生命科學(xué)的發(fā)展備受各國(guó)的重視。我國(guó)在很多大學(xué)中都設(shè)立了生命科學(xué)院?,F(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn) 為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù),而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切 關(guān)系,特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展,細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價(jià)值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過(guò)程 中很多是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的?;蚬こ桃腋我呙绾芏嗍且訡HO細(xì)胞作為載體;細(xì)胞工程中更是離不細(xì)胞培養(yǎng), 雜交瘤單克隆抗體,*是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的,既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開(kāi)細(xì)胞培養(yǎng)。正 在倍受重視的基因治療、體細(xì)胞治療也要經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程才能實(shí)現(xiàn),發(fā)酵工程和酶工程有的也與細(xì)胞培養(yǎng)密切 相關(guān)??傊?,細(xì)胞培養(yǎng)在整個(gè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展,培養(yǎng)基的質(zhì)量 又是關(guān)鍵,而培養(yǎng)基的主要成份中動(dòng)物血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖發(fā)揮著重要甚至是難以替代的作用。在動(dòng)物血清的 應(yīng)用中牛血清又是為廣泛的,所以牛血清是醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)品中重要的原材料之一。保證牛血清質(zhì)量也是促進(jìn) 生物制品質(zhì)量提高的重要環(huán)節(jié)。 

 

一、 牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要功能 

牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中用量大的天然培養(yǎng)基,含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成份,具有極為重要的功能。  

1.提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒(méi)有或量很少的營(yíng)養(yǎng)物,以及主要的低分子營(yíng)養(yǎng)物。 

2. 提供結(jié)合蛋白,能識(shí)別維生素、脂類(lèi)、金屬和其他激素等,能結(jié)合或調(diào)變它們所結(jié)合的物質(zhì)活力。 

3.有些情況下結(jié)合蛋白質(zhì)能與有毒金屬和熱原質(zhì)結(jié)合,起到解毒作用。 

4.是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子來(lái)源。 

5.起酸堿度緩沖液作用。 

6.提供蛋白酶抑制劑,使在細(xì)胞傳代時(shí)使剩余胰蛋白酶失活,保護(hù)細(xì)胞不受傷害。 

 

二、 牛血清的主要成份 

血清是一種很復(fù)雜的混合物,其組成成份雖大部分已為人所知,但還有一部分尚不清楚,而且血清組成及含量常 隨供血?jiǎng)游锏男詣e、年齡、生理?xiàng)l件和營(yíng)養(yǎng)條件不同而異。  

1.蛋白質(zhì)是牛血清中主要成份。除包括可攜帶金屬離子、脂肪酸和自身是激素類(lèi)蛋白外主要還有白蛋白,球蛋白。 纖維粘連素 細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞附著; α2 巨球蛋白 抑制胰蛋白酶的作用;胎牛血清中含胎球蛋白 促細(xì)胞附著;轉(zhuǎn)鐵蛋白 能結(jié)合鐵離子,減少其毒性 和被細(xì)胞利用。  

2.多肽:血小板促生長(zhǎng)因子能促細(xì)胞分裂,是多肽家庭的主要成員之一,是主要的促細(xì)胞增殖因子;成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子等,血清中含量雖很少,但對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也有一定作用。  

3.激素:激素對(duì)細(xì)胞的作用是多方面的。 

胰島素:促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖和氨基酸,與促細(xì)胞分裂有關(guān)。 

類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子:能與細(xì)胞表達(dá)的胰島素受體結(jié)合,從而有胰島素同樣的作用。 

促生長(zhǎng)激素:促細(xì)胞增殖效應(yīng)。 

Hydrocortisone:血清中含有定量的該成分,它可能兼有促細(xì)胞貼附和增殖作用,但有人證明,血清中的Hydrocortisone ,如細(xì)胞密度高時(shí)可能有抑制細(xì)胞的作用和誘導(dǎo)其發(fā)生分化。  

4其他成份 

氨基酸、葡萄糖、酮酸等對(duì)多種營(yíng)養(yǎng)成分的合成培養(yǎng)基意義不大。與蛋白相結(jié)合狀態(tài)的微量元素對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有意 義。 

 

三、 牛血清的質(zhì)量要求 

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和生活水平的不斷提高對(duì)生物醫(yī)藥產(chǎn)品的質(zhì)量要求也越來(lái)越高,所以對(duì)制備工藝中所涉及到 的各種原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求也越來(lái)越高,特別是對(duì)用于細(xì)胞培養(yǎng)基中的主要天然成份――牛血清的質(zhì)量要求也 不斷提高。牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清。  

(一)、WHO公布的《用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品規(guī)程》中的要求:  

1. 牛血清必須來(lái)自有文件證明無(wú)牛海綿狀腦病的牛群或國(guó)家。并應(yīng)具備適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)系統(tǒng)。 

2. 有些國(guó)家還要求牛血清來(lái)自未用過(guò)反芻動(dòng)物蛋白飼料的牛群。 

3. 證明所用牛血清中不含對(duì)所生產(chǎn)疫苗病毒的抑制物。 

4. 血清要通過(guò)濾膜過(guò)濾除菌,保證無(wú)菌。 

5. 無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體和病毒的污染,有些國(guó)家要求無(wú)細(xì)菌噬菌體污染。 

6. 對(duì)細(xì)胞有良好的支持繁殖作用。 

(二)、我國(guó)在對(duì)牛血清的質(zhì)量2000年版《中國(guó)生物制品主要原輔料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》中提出比較嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)要求。包 括蛋白質(zhì)含量,細(xì)菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細(xì)菌內(nèi)毒素,支持細(xì)胞增殖檢查。  

(三)、美國(guó)對(duì)牛血清的質(zhì)量要求:Gibco 和Sigma二家主要的美國(guó)牛血清供應(yīng)商的牛血清都已進(jìn)入到我國(guó)市場(chǎng),他們對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求都極為嚴(yán)格,從血清來(lái)源到產(chǎn)品質(zhì)量都有明確規(guī)定。  

1) 血清來(lái)源:可從世界各國(guó)收集胎牛血清,但是必須符合他的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和美國(guó)農(nóng)業(yè)部進(jìn)口要求。地方當(dāng)局還不 清楚本地是否有牛海綿狀病毒流行的血清不收集,有說(shuō)明血清質(zhì)量的證明資料:包括收集過(guò)程的全部資料、檢驗(yàn) 結(jié)果和交付情況。 

2)血清的收集:胎牛血清是心臟穿刺取血,新生牛(10~14天)和小牛(10個(gè)月內(nèi))血清靜脈取血。血清采集條 件必須符合工業(yè)生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn):低溫下采集、一次分離、分離后立即混合凍存。符合要求的血清56℃水浴30分鐘滅 活。 

 

3)血清的制備: 

a. 超低IgG胎牛血清:通過(guò)親和層析工藝去除胎牛血清中的γ球蛋白,使FBS γ球蛋白含量減到低,一般IgG≤5ug/ml,生物學(xué)活性不變。  

b. 血清透析:用12000~14000分子量的透析膜在0.15M NaCl中透析直到使葡萄糖含量<0.5mg/ml(用葡萄糖氧 化酶/過(guò)氧化酶方法測(cè)定)。  

c. γ-射線照射:已經(jīng)證明γ-射線照射可以有效滅活血清中可能污染的病毒、支原體。照射劑量為30~45KG。 而且這個(gè)劑量的γ-射線照射不會(huì)改變血清的理化性質(zhì)和對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響。 

4)除菌過(guò)濾:經(jīng)過(guò)上述處理的粗制血清再經(jīng)過(guò)一系列除菌濾膜過(guò)濾包括0.2微米(micron)和0.1微米濾膜。FBS要 通過(guò)三層0.1微米濾膜,其他血清可通過(guò)0.2微米濾膜。 

 

4.終產(chǎn)品血清質(zhì)量 

1)化學(xué)檢定:滲透壓 pH 蛋白含量――電泳法 白蛋白 球蛋白 血紅蛋白 隨著牛年齡增加血清中總蛋白含量相應(yīng)增加,總的血清蛋白含量可以確定產(chǎn)品規(guī)格和年齡。 

2) 微生物學(xué)檢查:細(xì)菌、真菌符合USP標(biāo)準(zhǔn)。 

支原體:在支原體專(zhuān)業(yè)培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3~4周,培養(yǎng)溫度36℃±2℃ 分別在需氧和厭氧條件下進(jìn)行,有的還需要在支原體瓊脂培養(yǎng)皿上傳4次,Hoechst熒光素DNA染色檢查那些培養(yǎng)法 無(wú)法檢出的支原體如豬鼻支原體等。  

病毒檢查: 

牛蘭舌病毒 Bovin blue tongue 

牛腺病毒 Bovine Adenovirus 

牛細(xì)小病毒 Bovine Parvovirus 

牛病毒性腹泄病毒 Bovine Viral Diarhea Virus 

狂犬病病毒 Rabies 

呼腸弧病毒 Reovirus 

牛呼吸道合胞病毒 BRSV 

副流感病毒Ⅲ型 Parainfluenza 

 

檢查方法: 

已證明無(wú)外源因子污染的牛細(xì)胞培養(yǎng)物,在細(xì)胞生長(zhǎng)液中加15%待測(cè)血清,連傳3代共21天。陰性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)液 中加15%已知無(wú)病毒污染的牛血清,與試驗(yàn)組同條件下進(jìn)行。在觀察期內(nèi)注意細(xì)胞形態(tài)變化或細(xì)胞病變。在觀察 期內(nèi)第14天待檢樣品和對(duì)照樣品用標(biāo)準(zhǔn)病毒檢測(cè)方法檢查。  如待檢細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)胰酶消化后分種到6個(gè)含蓋玻片的容器內(nèi)。陰性對(duì)照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細(xì) 小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養(yǎng)物蓋玻片容器內(nèi)作為陽(yáng)性對(duì)照,再培養(yǎng)7天,用熒光 抗體技術(shù)進(jìn)行檢查。  細(xì)胞病變或病毒引起的其他改變通過(guò)蘇木精或伊紅染色進(jìn)行觀察。取另外一個(gè)待檢細(xì)胞培養(yǎng)瓶用人“O”紅細(xì)胞、 豚鼠紅細(xì)胞和新鮮雞紅細(xì)胞作血球吸附病毒檢查。試驗(yàn)在2~8℃和20~24℃進(jìn)行。陰性對(duì)照細(xì)胞預(yù)先感染副流感 Ⅲ型病毒作為陽(yáng)性對(duì)照。未感染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。 

3)內(nèi)毒素檢測(cè) 

用鱟試劑檢查。  

4)細(xì)菌噬菌體檢查 

主要檢查E.Coli(C300 or K-12)噬菌體。 

5)激素含量測(cè)定 

每批FBS對(duì)某些激素含量都要進(jìn)行測(cè)定,包括:雌二醇、胰島素、孕硐、睪丸素、甲狀腺素等。 

6)血紅蛋白檢測(cè) 

血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥70%,血紅蛋白含量≤mg15/dl。 

7)細(xì)胞生長(zhǎng)效果測(cè)定 

a.細(xì)胞克隆效果測(cè)定 

細(xì)胞選擇:Sp20/Ag-14 或P3X63-Ag8.653 

血清濃度與細(xì)胞數(shù): 

10%血清/1個(gè)細(xì)胞/孔 

4%血清/5個(gè)細(xì)胞/孔 

細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640, 96孔培養(yǎng)盤(pán)36℃±2℃,5%二氧化碳培養(yǎng)10~ 

15天。試驗(yàn)中選擇一個(gè)已知參考牛血清作對(duì)照。 

克隆效率計(jì)算: 

克隆效率=(陽(yáng)性孔平均數(shù)/ 培養(yǎng)孔總數(shù)) X100%  

相對(duì)克隆效率=待測(cè)血清克隆效率/參考血清克隆效率 

b.貼壁效率試驗(yàn): 

用人的傳代細(xì)胞作每批血清的貼壁效率試驗(yàn),A549(人肺癌細(xì)胞)該細(xì)胞可以反應(yīng)出低濃度血清的貼壁變化。采 用6孔培養(yǎng)盤(pán)每批血清用兩種濃度和兩種不同的細(xì)胞接種數(shù)即10%血清――100細(xì)胞/孔,4%血清200介細(xì)胞/孔 。放36℃±2℃,濕潤(rùn)5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)10~14天,計(jì)算著色細(xì)胞克隆,確定貼壁效率。從這兩種不同血清 濃度來(lái)確立實(shí)驗(yàn)血清支持細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的水平,分析兩種試驗(yàn)條件下平均貼壁效率。  

貼壁效率(%)=(每孔克隆平均數(shù)/ 每孔活存的培養(yǎng)細(xì)胞平均數(shù)) X100% 

相對(duì)貼壁效率=被測(cè)血清貼壁效率/參考血清貼壁效率 

c. 二倍體纖維細(xì)胞促生長(zhǎng)試驗(yàn) 

人二倍體細(xì)胞株   WI28   MRc5 

25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶,5%血清,每瓶接種1.5X105細(xì)胞連傳3代,每代血清濃度和接種細(xì)胞數(shù)相同,每代培養(yǎng)7天,每 代接種二個(gè)細(xì)胞瓶,36℃±2℃培養(yǎng)。以同樣條件用已知參考血清進(jìn)行平行培養(yǎng)。每代收獲細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算每批待 檢血清與參考血清的相對(duì)生長(zhǎng)率(RGR)。 

RGR=(試驗(yàn)血清每瓶細(xì)胞平均數(shù)/ 參考血清每瓶細(xì)胞平均數(shù)) X100% 

牛血清主要質(zhì)量要求(Sigma)  

胎牛血清 新生牛血清 成牛血清  

牛齡 胎 10~14天 <10個(gè)月  

無(wú)菌 - - -  

病毒 - - -  

支原體 - - -  

噬菌體 - - -  

內(nèi)毒素(ng/ml) ≤1.0 ≤10.0 ≤10(15)  

血紅蛋白(g%) 3.0~4.5 3.5~6.0 5.0~8.5  

pH 6.7~8.0 7.0~8.0 7.0~8.0  

滲透壓(mom/Kg H2O) 240~340 240~340 240~340  

 

新的藥品管理法即將公布,新的藥品管理法對(duì)生物制品提出更嚴(yán)格的質(zhì)量要求。特別是我國(guó)即將加入WTO,會(huì)有更 多的國(guó)外生物制品進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng),我國(guó)的生物制品也希望更多地走向市場(chǎng),所以在制品質(zhì)量上要求會(huì)更高, 產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)應(yīng)主要靠質(zhì)量競(jìng)爭(zhēng)。所以對(duì)產(chǎn)品中的主要原材料的質(zhì)量要求也會(huì)越來(lái)越嚴(yán)格。如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物我國(guó)SDA 已提出嚴(yán)格的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),并提出全國(guó)各使用部門(mén)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的期限。為了貫徹2000年版《中國(guó)生物制品規(guī)程》標(biāo)委 會(huì)修訂了《中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》其中包括了生產(chǎn)用牛血清的質(zhì)控要求,這是一個(gè)低要求,和國(guó) 外產(chǎn)品的要求還有差距,希望各牛血清生產(chǎn)單位和使用單位,自己能制定出更高更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn),以進(jìn)一步提高我國(guó)生物制品質(zhì)量。

TEL:18016231680

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